Klinik örneklerden izole edilen karbapenem dirençli pseudomonas aeruginosa izolatlarındaki antibiyotik direncinin moleküler analizi

Abstract

Pseudomonas aeruginosa riskli hasta gruplarında morbidite ve mortalitede artışa neden olan fırsatçı patojendir. Karbapenem direncinin tehdit haline geldiği günümüzde, direnç genleri mobil genetik elemanlar aracılığıyla türler arasında yayılmaktadır. P.aeruginosa arasında karbapenemazların yayılımı, enfeksiyonların tedavisindeki seçenekleri sınırlamasından dolayı ciddi bir halk sağlığı sorunudur. Bu çalışmada, Ekim 2021 ile Mart 2023 tarihleri arasında Kocaeli Üniversitesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi Merkez Laboratuvarı Bakteriyoloji Biriminde çeşitli klinik örneklerden izole edilen 47 adet karbapeneme dirençli P.aeruginosa (KDPA) izolatının moleküler epidemiyolojisinin araştırılması amaçlanmıştır. Antibiyotiklere karşı direnç oranları, bazı karbapenemaz ve virülans genleri, konjugatif direnç plazmitleri, integron gen kaseti içerikleri ve izolatlar arasındaki klonal benzerlikler araştırılmış ve epidemiyolojik olarak değerlendirilmiştir. Bu çalışmada, bakteri izolatlarının tanımlanması ve bazı antibiyotiklere (imipenem, meropenem, aztreonam, amikasin, netilmisin, tobramisin, piperasilin, piperasilin/tazobaktam, seftazidim, sefepim, siprofloksasin ve levofloksasin) karşı duyarlılık testleri VITEK®2 Compact otomatize sistemle yapılmıştır. İzolatların metalo-beta-laktamaz (MBL) üretimi imipenem/meropenem-EDTA (IMP/MEM-EDTA) kombine disk yöntemiyle gösterilmiştir. Konjugasyon deneyleri sıvıda çiftleştirme (broth mating) yöntemiyle yapılmıştır. Plazmit DNA izolasyonlarında alkali lizis yöntemi kullanılmıştır. Transkonjugantlardaki ko-transfer edilen antibiyotik dirençleri disk difüzyon yöntemiyle belirlenmiştir. Karbapenemaz genleri (blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaKPC ve blaOXA-48), integron gen kasetleri (sınıf 1 ve sınıf 2) ve virülans genleri (lasR ve rhlR) polimeraz zincir reaksiyonu [polymerase chain reaction (PCR)] ile belirlenmiştir. İzolatların klonal ilişkileri ‘enterobacterial repetitive intergenic consensus’ (ERIC)-PCR’den elde edilen DNA parmak izi analizlerinin değerlendirilmesiyle araştırılmıştır. Karbapeneme dirençli P.aeruginosa izolatlarının en dirençli bulunduğu antibiyotik levofloksasin olup en düşük direnç oranları tobramisin, gentamisin ve amikasine karşı gözlenmiştir. Yirmi beş (%53.2) izolatta MBL üretimi tespit edilmiştir. Konjugasyon deneylerinde 12 (%25.5) izolatta konjugatif direnç plazmiti belirlenmiştir. KDPA izolatlarının %90’ında PCR ile lasR ve rhlR (transkripsiyonel aktivatör proteini kodlayan genler) biyofilm genleri belirlenmiştir. Altı (%12.8) izolatta blaVIM geni, beş (%10.6) izolatta blaNDM geni, üç (%6.4) izolatta blaOXA-48 geni saptanmıştır. blaKPC ve blaIMP genleri KDPA izolatlarında tespit edilmemiştir. Konjugatif plazmit içeren izolatların ikisinin (%16.6) blaVIM geni, birinin (%8.3) blaNDM geni, birinin (%8.3) blaOXA-48 geni taşıdığı belirlenmiştir. İntegron-spesifik PCR ile 39 (%82.9) izolatta intI1 geni tespit edilirken, 24 (%51)’ünün sınıf 1 integron gen kaseti taşıdığı belirlenmiştir. Konjugatif plazmit içeren izolatların altısının sınıf 1 integron gen kaseti taşıdığı belirlenmiştir. KDPA izolatlarında sınıf 2 integronlara rastlanmamıştır. ERIC-PCR paternlerinin dendrogram analizinde KDPA izolatları arasında klonal benzerlik olmadığı ve izolatların çapraz bulaş ile yayılmadığı belirlenmiştir. Sonuç olarak, lasR ve rhlR biyofilm genlerine sahip bazı KDPA izolatlarının çoğunun karbapenemler haricinde diğer antibiyotik gruplarına da yüksek oranda direnç gösterdiği ve bazı antibiyotik dirençlerini (seftazidim, sefepim, siprofloksasin, levofloksasin, piperasilin-tazobaktam) konjugatif direnç plazmitleriyle ko-transfer edebildiği görülmüştür. Klinik arenada salgına neden olabilecek potansiyeldeki bu suşların direnç gen rezervuarlarında moleküler epidemiyolojik olarak takip edilmesinin yararlı olacağı düşünülmektedir

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that causes increased morbidity and mortality in risky patient groups. Nowadays, carbapenem resistance has become a threat and resistance genes are spreading among species through mobile genetic elements. The dissemination of carbapenemases among P.aeruginosa is a serious public health concern due to its limited options for the treatment of bacterial infections. In this study, it was aimed to investigate the molecular epidemiology of 47 carbapenem resistant P.aeruginosa (CRPA) isolates derived from various clinical samples from the Central Laboratory Bacteriology Unit of Kocaeli University Research and Training Hospital between October 2021 and March 2023. The rates of resistance to the antibiotics, some carbapenemase and virulence genes, conjugative resistance plasmids, integron gene cassette contents and the clonal similarity of the isolates were investigated and then epidemiologically evaluated. In the study, identification of the bacterial isolates and their susceptibility to some antibiotics (imipenem, meropenem, aztreonam, amikacin, netilmicin, tobramycin, piperacillin, piperacillin/tazobactam, ceftazidime, cefepime, ciprofloxacin and levofloxacin) were determined by the VITEK® 2 Compact automated system. Metallo-beta-lactamase (MBL) production of the isolates was demonstrated by the imipenem/meropenem-EDTA (IMP/MEM-EDTA) combined disc method. Conjugation experiments were performed by the broth mating method. Alkali lysis method was used in plasmid DNA isolations. Co-transferred antibiotic resistances in transconjugants were detected by disc diffusion method. Carbapenemase genes (blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaKPC and blaOXA-48), integron gene cassettes (class 1 and class 2) and virulence genes (lasR and rhlR) were screened by specific polymerase chain reactions (PCRs). Clonal relationships of the CRPA isolates were investigated by evaluating the DNA fingerprintings obtained from the ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus)-PCR assay. The highest resistance rate of the isolates were to levofloxacin, while the lowest resistance rates were observed against tobramycin, gentamicin and amikacin. MBL production was detected in 25 (53.2%) isolates. In conjugation experiments, 12 (25.5%) isolates were detected to harbour conjugative resistance plasmids. In 90% of the CRPA isolates, lasR and rhlR biofilm genes (encoding for the transcriptional activator protein) were detected by PCR. The blaVIM gene was detected in six (12.8%) isolates. The blaNDM gene was detected in five (10.6%) isolates and the blaOXA-48 gene was detected in three (6.4%) isolates. The blaKPC and blaIMP genes were not detected in CRPA isolates. It was determined that two (16.6%) of the isolates that carried the blaVIM gene, one (8.3%) carried the blaNDM gene and one (8.3%) carried the blaOXA-48 gene contained conjugative plasmids.In integron-specific PCRs, intI1 gene was positive in 39 (82.9%) isolates, while class 1 integron gene cassettes were detected in 24 isolates (51%). IntI1 positive six isolates were found to harbour class 1 integron gene cassettes-bearing conjugative plasmids. Class 2 integrons were not found in the CRPA isolates. Dendrogram analysis of ERIC-PCR patterns showed that there was no clonal similarity between the CRPA isolates and the isolates did not spread by cross-contamination. As a result, it has been observed that most of the CRPA isolates which have the potential to form biofilms, are highly resistant to other antibiotic groups other than carbapenems and can co-transfer some resistances (ceftazidime, cefepime, ciprofloxacin, levofloxacin, piperacillin-tazobactam) with conjugative resistance plasmids. It is thought that it would be useful to follow molecular epidemiology in the resistance gene reservoirs of these strains which have the potential to cause epidemics in the clinical arena.